抗血栓纳米药物综述：心血管疾病个体化精准诊疗新策略
研究背景
血栓形成与许多心血管疾病有关，如心肌梗死和中风。它是一个全球性的健康问题，也是导致死亡的主要因素之一。但是，目前血栓形成的临床诊断局限于疾病晚期，从而导致治疗窗口狭窄，难以提供合理有效的治疗。另外，临床用的溶栓药物，通常半衰期短，且可能会引起过敏反应及产生不必要的组织出血等问题。结合纳米药物在疾病诊疗中的优势，利用纳米药物在血栓形成的诊断和治疗也取得了较好的效果，引起科研人员的广泛关注。
本文亮点
内容简介
厦门大学刘刚教授课题组在本综述中总结了纳米药物在血栓诊断和治疗的最新进展，按照功能分为六种类型的纳米体系：1)使用“合成生物标志物”构建的体外诊断体系；2)使用纳米探针进行血栓的体内诊断；3)靶向性载药系统应用于溶栓治疗；4)血栓微环境响应给药系统；5)仿生纳米给药系统；6)基于外部激发的纳米治疗体系。最后，我们展望了纳米药物在临床中血栓形成诊断和治疗需要满足的条件，以及该领域后续发展的方向。
图文导读
I 纳米药物在血栓诊断中的应用
1.1 体外诊断体外诊断因其简单、快速、无侵袭性等优点而被广泛研究，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)已应用于医院诊断。以纳米颗粒为基础的体外诊断已被用于检测疾病的生物标志物。然而，与血栓相关的生物标志物仅存在于血凝块中，在血液中没有显著的生物标志物，因此体外诊断无法直接检测到这些标志物。通过设计包含“合成生物标志物”的纳米复合物，在注射后可以在血栓区域代谢后释放“合成生物标志物”，并且通过肾脏过滤到尿液中。进一步的收集尿液，就可以实现“合成生物标志物”的测试。Bhatia等人以氧化铁纳米虫(NWs)作为含有血栓响应肽(TAP)-标记肽序列的纳米载体(图1-a)。制备的纳米复合材料对凝血酶有选择性，并且在凝血酶活性作用下释放多肽片段。收集尿液后，利用ELISA和试纸可以实现多肽片段的测定。但是这种体系需要较长时间的代谢，无法实现血栓的快速测定。在进一步的研究中，Bhatia等将TAP多肽衍生物偶联到聚乙二醇支架(PEG-T1E)表面，制备另一种“合成生物标志物”纳米复合材料(图1-b)。该PEG-T1E的水动力直径约为8 nm，可以促进纳米复合材料的皮下注射进入血流。此外，皮下注射合成生物标记物3 h后，就可以在尿液中测试到“合成生物标志物”，从而实现血栓的快速诊断。
图1. 基于“合成生物标志物”的血栓症体外诊断。
1.2 体内成像
目前，已经有许多体内成像方法用于血栓的诊断，其中超声成像(US)、磁共振成像(MRI)和正电子发射断层成像(PET)在血栓的临床诊断中得到广泛应用。然而，常规影像学方法仅适用于晚期血栓，对血栓形成的早期诊断和评估仍难以实现。已知许多生物学特性，如纤维蛋白、活化的血小板、因子XIII等，都与血栓的形成密切相关。血栓形成相关生物标志物的可视化是现代分子成像的基础，进一步的研究对于疾病的精准治疗是必要的。
结合纳米探针良好的成像性能，含有靶向分子的纳米颗粒造影剂可以用来准确检测血栓。2017年，Cui等制备了二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧基二亚胺(PDI)衍生物，并将其组装成有机半导体纳米颗粒(~40 nm)，该纳米粒子具有优异的光声(PA)性能(图2)。进一步表面靶向修饰后，将cRGD-PDI纳米颗粒静脉注射到体内，并且通过PAI进行研究。如图2所示，cRGD-PDI纳米颗粒能够识别出早期血栓，显示出良好的成像性能。此外，cRGD-PDI纳米颗粒可以区分早期血栓和晚期血栓，有助于理解血栓溶解过程。
基于纳米结构的体内成像诊断已成为研究最多的方法。体内成像需要两个重要因素：1)纳米探针应具有突出的成像性能或在血栓形成的微环境中显示成像；2)表面修饰使造影剂具有较长的循环时间、血栓靶向性和适当的生物安全性。
图2.cRGD-PDI纳米颗粒的制备及在早期血栓症PAI中的应用。
II 纳米药物在血栓治疗中的应用
2.1 靶向性溶栓载药系统
纳米载药系统也应用在溶栓治疗中，并且已经验证有明显优于单纯溶栓剂的治疗效果。由于脂质体表面修饰，并且容易包裹药物，成为了溶栓剂的首选递送载体。此外，联合使用体外激发可以在血栓部位显示有效的释放，如回声性脂质体(ELIP)，采用脂质单分子层外壳，包裹八氟丙烷，并装载重组人组织型纤溶酶原激活物(rt-PA)。该纳米复合材料注射体内后，在表面修饰的靶向分子作用下富集在血凝块中，局部外用US使rt-PA释放并激发空化活性，实现溶栓效果。
Colasuonno等利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乙二醇(PEG)制备了一种模拟红细胞的盘状纳米结构，其独特的结构可以防止药物在脑内积聚，减少脑出血。组织型纤溶酶原激活剂(tPA)被共轭在材料表面。纳米复合材料独特的结构使其在体内长期循环，并具有良好的溶栓效率。
除了溶栓药物外，基因治疗药物也被应用于溶栓治疗。为此，一类水蛭素重组质粒(pDNA)被构建，并通过凝血因子Xa(FXa)基因连接。此外，RGDyC和PEG在聚酰胺树状聚合物(PAMAM)上进行了改性。然后，pDNA可以吸附在PAMAM表面。利用表面修饰的RGDyC，pDNA可以靶向血栓部位。在血栓中，可以表达重组水蛭素融合蛋白，并且该蛋白同时表达的RGDyC可诱导抗血栓形成的第二次靶向效应。
随着研究的深入，更多的有机或无机纳米结构被应用于血栓的治疗中。这些递送体系的设计应考虑三个因素：1)纳米结构的形貌、大小和表面修饰应有助于纳米药物在血凝块中富集，而且纳米结构本身应具有低生物毒性；2)纳米药物应该具有较好的稳定性，并且在血液中溶栓药物不从纳米微载体释放；3)多功能纳米颗粒应该能够实现影像学指导。
2.2 血栓微环境响应给药系统
基于疾病微环境的药物精准释放从而减少健康组织中的药物释放的递送策略也被广泛研究。并且，这种释放策略非常适合于溶栓药物的释放，可以减少溶栓剂的副作用。在血栓形成过程中，过氧化氢(H2O2)在血小板活化中发挥着重要作用，并能够刺激额外的血小板聚集。因此，H2O2是活化血小板的一个重要的生物标志物，H2O2抑制剂可以区分出活化的血小板与正常的血小板，从而显示出特异性抗血栓的治疗效果。
Lee等人制备了H2O2响应的纤维蛋白靶向成像和抗血栓纳米复合物(FTIAN)(图3)。其中，FTIAN表面含有以纤维蛋白为靶点的多肽、响应H2O2的硼酸盐、荧光探针IR820共价结合聚合物，以及装载有溶栓剂(tirofiban)的内核。在血栓斑块中，由于H2O2的作用，FTIAN可以解聚，然后释放tirofiban。同时，减少H2O2可以下调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和可溶性CD40配体(sCD40L)。因此，FTIAN显示出抗氧化和抗炎作用，有利于抗血栓形成和溶栓。
图3.H2O2响应的溶栓治疗。
2.3 仿生纳米给药系统
除了有机或无机纳米结构，大量仿生纳米粒子也被应用在药物载运系统中。其中，细胞膜纳米粒子由于来源于细胞，并且具有生物相容性高、血液循环时间长、容易基因工程改造等特点，而被广泛研究。在血栓的形成中，最主要的过程是血小板的聚集和活化。因此，血小板膜具有聚集在血栓斑块中的能力，血小板膜(PM)包裹的纳米药物也被应用在血栓治疗中。2016年，Gu等人在PM包裹的纳米颗粒表面修饰了tPA，制备了仿生纳米溶栓剂。如图4所示，PM可以包覆在聚合物内核的表面，制备的tPA-PM-NP约为127 nm。并且，静脉注射后，该纳米复合物能够很好的聚集在肺血栓中。此外，在体内经过较长时间的循环后，tPA的仍然能够保持酶活性。将tPA-PM-NP注射到肺血栓模型后，纤维蛋白原的荧光强度明显降低。
图4. PM包裹的纳米溶栓治疗。
2.4 基于外部激发的纳米药物治疗体系
除了使用溶栓药物治疗外，还可以应用机械作用、热疗和活性氧等进行溶栓治疗。在体内成像的帮助下，仅在血栓部位进行激发可以减少对正常组织的损害。例如，Zhong等人将全氟化碳(PFH)包裹在PLGA纳米颗粒中，并将Fe3O4纳米颗粒加载到PLGA表面(图5)。进一步修饰靶向CREKA肽后构建了多功能相转变溶栓纳米药物。该多功能纳米复合物还具有MR、PA和US造影剂的性能，从而可以实现多模态成像指导下的体内血栓形成的诊断。在靶向多肽的作用下，纳米复合物可以富集在血栓斑块位置。然后，在血栓处通过低强度聚焦US(LIFU)激发，血块经历了血细胞的溶血、纤维蛋白降解和自变形后发生溶栓效果。
图6.多模态成像引导的HIFU血栓治疗。
III 结论和扩展
目前，许多基于纳米药物的血栓诊断和治疗方法已被报道，其中一些已经取得了较好的效果。我们总结了血栓诊断和治疗体系需要具备的条件：
1)首先，纳米药物在血栓部位的积累是临床治疗的前提。利用靶向抗体或多肽等对纳米药物进行修饰具有重要意义。同时，纳米药物的形态、大小和表面亲水性调节也影响纳米药物在血栓中的富集。
2)其次，溶栓药物可引起不良组织或部位出血，甚至引起其他心血管疾病或器官损害。利用血栓微环境或光/声/磁激发的给药系统，实现药物只能在血栓部位释放而正常组织内仅泄漏少量的可控释放，以降低副作用。
3)实时成像不仅可以将血栓斑块与其他正常组织区分开来，还可以提供血栓的详细信息。因此，影像引导下的治疗是个性化治疗的关键因素。
作者简介
主要是致力于医学影像探针、疾病诊疗一体化的研究。围绕重大疾病新生血管动物模型开展了一系列基础研究工作。
▍主要研究成果在Angewandte Chemie International Edition、Advanced Materials、 Advanced Functional Materials、Advanced Science、Theranostics等高影响力学术期刊以第一作者或通讯作者发表论文10 余篇。荣获福建省优秀博士毕业论文，中国生物医学工程学会优秀博士论文。获得授权中国发明专利6项，青年科学基金项目、博士后面上资助。
▍Email: chuchengchao0225@163.com主要从事分子影像探针、生物医用高分子、药物/基因传输体系等工作。
▍主要研究成果国家自然科学基金杰出青年基金、优秀青年基金获得者。入选中组部万人计划青年拔尖人才、教育部新世纪优秀人才、福建省特支计划科技创新领军人才等。作为通讯/并列通讯作者在PNAS、Nat Commun、Sci Adv、JACS、Adv Mater等国际知名杂志发表SCI论文80余篇，并入选科睿唯安(Clarivate Analytics)2019年度全球“高被引科学家”榜单。参编全国高校规划教材4部、英文专著12部。获得国家专利授权7项，其中2项进行了企业技术转移及临床转化。
▍Email: gangliu.cmitm@xmu.edu.cn▍个人主页: https://mitm.xmu.edu.cn/info/1012/1228.htm撰稿：原文作者
编辑：《纳微快报》编辑部
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